摘要：
甲病***必须能够同时和两种不同的宿主有效地相互作用，以便其在脊椎动物和蚊子宿主之间进行复制和传播。已知的一些与宿主来源相关的差异似乎有助于病***的传播。然而，宿主介导的病***基因组RNA修饰对随后感染的影响尚未被研究。在这里，我们发现在人类（HEK-293）细胞中，蚊子来源的辛德比斯病***（SINV）复制和传播速度更快，产生比哺***动物来源的更具传染性的病***。这种复制的增强既不是稳定性的差异，也不是感染基因组RNA产生的结果。然而，从蚊子来源的SINV中纯化的基因组RNA比哺***动物来源的SINV更有效地感染了HEK-293细胞，这表明两种宿主细胞中产生的基因组RNA本身是不同的，这种差异是感染的决定因素。我们证明了：蚊子细胞来源的SINV基因组RNA比哺***动物细胞来源的SINV基因组RNA能够更有效地翻译。通过LC/MS-MS方法我们发现这种差异归因于宿主依赖的基因组RNA的差异性修饰。我们的数据表明vRNA的修饰可能在SINV感染和复制的中发挥重要作用。
结果：
蚊子细胞来源的SINV在HEK-293细胞上复制更快
研究人员分别用BHK21细胞和C7/10蚊子细胞扩增了SINV-nsP3-GFP病***，发现C7/10蚊子细胞来源的病***的感染性（PFU/Genomes）为0/61，而BHK21细胞来源的病***感染性（PFU/Genomes）为0/01。随后，通过测定C7/10蚊子细胞来源的和BHK21细胞来源的SINV-nsP3-GFP病***在HEK-293细胞上的荧光丰度和病***滴度，发现C7/10蚊子细胞来源的病***复制更快。
图1：C7/10细胞和BHK细胞来源的SINV在HEK293细胞中的复制
蚊子细胞来源的SINV基因组翻译效率更高
研究人员通过测定RLuc的产生发现，C7/10细胞比BHK细胞来源的SINV病***感染HEK-293细胞产生更高水平的RLuc。两种细胞来源病***的基因组RNA稳定性相似，但蚊子细胞来源的SINV基因组RNA翻译成病***蛋白的效率更高。
图2：蚊子细胞来源的病***比哺***动物细胞来源的病***，能够更有效地翻译
vRNA是病***感染中宿主细胞来源依赖性差异的决定因素
如前所述，甲病***在蚊子细胞中获得的已知的分子特征可以增强其感染哺***动物细胞的能力。因此，为了区分已知的适应和可能的vRNA变化，接下来将评价vRNA本身是否足以引起相同的表型。为了确定蚊子和哺***动物来源病***之间观察到的差异是否由于vRNA的变化，我们对BHK-21-和c7/10来源的SINV-nsP3-Nluc纯化的vRNA进行了转染实验。SINV-nsP3-Nluc分别在BHK- 21或C7/10细胞中培养24或48 h。HEK-293细胞分别转染108个纯化vRNA的病***基因组拷贝（通过qRT-PCR检测）。从C7/10细胞衍生的病***中提取的纯化的vRNA转染到HEK细胞中，与从BHK-21衍生的病***中纯化的vRNA相比，荧光素酶活性显著提高。这些结果表明，病***基因组RNA是之前观察到的病***感染增强的决定因素，并且病***基因组RNA存在宿主依赖的差异。
图3：病***RNA的出纯化
蚊子和哺***动物细胞来源的病***之间的RNA修饰谱存在显著差异
鉴于蚊子来源的病***的纯化vRNA至少部分导致了HEK-293细胞中复制能力的增强，作者推测这可能涉及宿主对病***基因组RNA的特异性修饰。通过对纯化病***粒子的vRNA中总基因组中修饰的核苷酸进行LC-MS/MS分析发现，这两种哺***动物细胞在病***基因组中产生了非常相似的修饰核苷酸数量，而蚊子衍生的病***的RNA在一些修饰核苷酸的数量上有所不同。在哺***动物细胞来源的vRNA中，m5C修饰的量较低，而在蚊子细胞来源的vRNA中，m5C修饰的比例显著增加。另一个有趣的观察发现是在哺***动物细胞来源的vRNA中，m6A修饰的比例显著更高。因此，作者得出结论：细胞类型对SINV子代病***粒子的RNA修饰谱有影响，而这些RNA修饰谱的差异导致蚊子细胞来源病***的vRNA在哺***动物细胞中的翻译增强，从而促进了病***的复制。
图4：LC/MS分析揭示了SINV获得的物种特异性修饰
讨论：
RNA修饰对病***RNA的影响是一个新出现的领域，已经有证据表明RNA修饰对病***生命周期有重要作用。我们对RNA修饰对甲病***的影响，或者这些修饰是否因病***来源的宿主而不同知之甚少。本研究使用液相色谱和质谱法显示：蚊子来源的SINV和哺***动物来源的SINV具有显著不同水平的不同RNA修饰。例如，本文发现蚊子来源的SINV的m5C修饰明显多于哺***动物对应的SINV，而m6A的修饰则相反。这是一个有趣的发现，因为之前的研究表明m5C和m6A修饰对虫媒病***都有影响。更具体地说，m5C已被证明对沃尔巴克氏菌在昆虫细胞中阻断病原体有重要作用，而m6A的修饰已在哺***动物细胞中已有广泛研究。导致m6A修饰在蚊子和哺***动物来源的病***中存在差异的原因可能有： (i)如之前的研究表明的那样，m6A修饰在哺***动物细胞系统对其他虫媒病***的感染具有重要作用；（ii）有证据表明，m6A修改可以帮助病***在哺***动物细胞中，而不是在蚊子细胞中，逃避免疫感受器RIG-I的识别。
病***基因组RNA中的修饰可以影响多种方面，包括但不限于RNA的稳定性、RNA定位和翻译效率。另一个令人困惑的是研究单个RNA修饰效应是很困难的，因为仅凭一个修饰可能不足以引起任何表型。沿着这些思路，这些RNA修饰是如何相互作用的还没有被很好地理解，而表观遗传相互作用的可能性增加了对生物学后果的分析和解释的复杂性。最后，甲基化阅读器的影响也不容忽视。虽然有强有力的证据表明m6A阅读器，特别是YTH蛋白家族对黄病***RNA的功能有重要作用，但目前尚无没有报道的证据表明该阅读器对SINV或其他甲病***有何作用。
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