实验步骤：
HEK-293T细胞以 4×10∧5个/孔铺于24孔板，37℃培养12~24h。
2/ 当细胞密度达 60~80%时，转染报告质粒pIFN-β-Fluc（250ng）、 内参质粒pTK-Rluc（2-6ng）、目的基因或空载体（250ng）。阳性对照就是转染能够***IFN-β表达的质粒。想要检测目的基因调控哪个通路，就转染对应通路的***质粒，或用对应通路的药物处理过夜（如poly I：C）。每组做3个重复（有时候3个重复其中1个偏差较大，可以做4-5个重复），37℃培养 24 h。
3/ 弃培养基， 用 PBS 清洗细胞3次，吸净残留液体。按照双荧光素酶报告系统检测试剂盒说明书，用80 µL的1×裂解液加入24 孔细胞培养板，4℃水平摇***裂解20 min；取 30 µL 细胞裂解液上清加至 96 孔板，在避光条件下，分别向各孔加入等体积的荧光素酶底物显色液，用多功能酶标仪测定或单管式荧光检测仪。
4/ 读取Fluc信号后，向各孔分别加入等体积的荧光素酶终止液（stop buffer），测定Rluc值。
5/ 通过计算Fluc/Rluc 的比值， 即完成对IFN-β启动子活性的检测。将未处理组的Fluc/Rluc比值设定为1，那么***组的Fluc/Rluc除以未处理组的Fluc/Rluc比值即激活倍数。
想要检测哪个基因的表达水平，就把对应基因的启动子***到FLuc前，用该基因的启动子来启动FLuc的转录。类似的，该方法也适用于病***基因的转录调控研究，即将病***基因组的5 UTR（或其他的启动子元件如甲病***的亚基因组启动子）***至FLuc前。
常见问题：
Rluc信号检测结果overload
原因：A）内参质粒pTK-Rluc转染太多，可减少内参质粒转染量。B）样品或检测试剂加多了，需要同时减少样品量和检测试剂量，因为是1/1/1的关系。
2/ 药物***不起来
原因：HEK-293T细胞不表达对应药物的受体，比如用LPS***无响应，因为HEK-293T细胞不表达TLR4受体（也不表达其他TLRs）。这时候需要同时转染***物对应的受体。HEK-293T可以响应IL-1β或TNFα等，做之前最好查一下文献是否对你的药物有响应。
3/ 目的基因转染组的F-Luc信号和R-Luc信号都很低。
原因：目的基因可能抑制基因转录或翻译。需要进行转录抑制检测或蛋白翻译抑制检测。这种情况的前提是转染目的基因组的Fluc和Rluc同时低于对照组。
读到这里别退出，后面也很精彩。
学会这个干扰素双荧光报告/FLuc-IFNβ reporter怎么保命？避免大家一看就会，一做就废，下面开始上案例。
来看一篇文章《基孔肯雅病***编码的nsp2，E2和E1强烈抑制β-干扰素信号通路》，分不高，但是操作简单易上手，适合刚入坑的朋友或者时运不济需要临时保命的老油子。
基孔肯雅病***的基本情况：基孔肯雅热病***（Chikungunya virus，CHIKV）在斯瓦希里语或马孔德语中名为Kun qunwala，表示“弯曲”的意思。CHIKV感染的症状包括关：发烧、肌痛、头痛、皮疹和关节痛等。急性症状可持续 2-3 周，但多发性关节痛可能持续数年。CHIKV最早是1952年在东非被发现的，主要由埃及伊蚊和白纹伊蚊传播的一种甲病***（alphavirus）。在2005-2006年期间，印度洋爆发了多次CHIKV疫情，并蔓延到印度，造成了150多万人感染。该病***通过旅行者进一步传播到欧洲和美国。2007年意大利，2010年在法国报告了欧洲最新的CHIKV流行。近期FDA即将批准的首个CHIKV***就是法国Valneva公司研发的，最初可能主要推荐给美国旅行者使用。CHIKV是一种单股正链RNA病***，有囊膜，基因组长约11/8kbp。CHIKV编码非结构多聚蛋白Nsp1234，然后被切割成单个的nsp1、nsp2、nsp3和nsp4，编码的结构多聚蛋白Capsid-E3-E2-6K-E1也会被capsid、furin和信号肽酶切割成单个的结构蛋白。
这篇文章就是从CHIKV编码的9种蛋白中筛选出来抑制干扰素通路的蛋白。把CHIKV编码的几个基因构出来质粒，然后分别用MDA5/RIG-I-MAVS-TBK1-IKK-IRF3通路上的质粒去***。非常简单，整篇文章就下面几张图，没什么好讲的。
如果你有干扰素或NF-κB通路的质粒，像小编一样有条件的，可以把RIG-I/MAD5通路、cGAS-STING通路、TNFα通路、TLRs通路都筛一遍，肯定能捞到一些东西的，毕竟鸟屎都能超导，抓把土都和干扰素通路有关系。筛到通路，找个互作的背锅侠，表型、定位和机制整一整，命就保住了。
需要相关通路质粒的私信小编吧。
文章中图1、2、3、4全在这了（Sojung Bae et al/ 2019/J/ Microbiol/ Biotechnol）
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