摘要：
非洲猪瘟病***（ASFV）编码多种抑制因子调节包括I型干扰素和细胞凋亡在内的先天免疫反应。本研究从I型Benin 97/1强***基因型分离株中缺失BCL-2家族A179L基因。在感染的巨噬细胞中，A179L基因的缺失导致caspase-3和caspase-7的活性增加，膜联蛋白V与表面***脂酰丝氨酸结合，以及通过末端脱氧核苷酸转移酶末端标记测量的DNA片段增加。这些结果证实了A179L缺失的病***感染的巨噬细胞更早地诱导细胞凋亡。通过荧光蛋白表达的检测发现A179L基因缺失病***的细胞入侵增加。通过与Annexin V结合阻断病***后，这种进入的增加被抵消，这表明入侵是由***脂酰丝氨酸受体介导的。感染******粒子的产量在单个复制周期中相似，但A179L基因缺失病***在多步生长周期中显著降低。免疫Benin-ΔA179L病***的猪不表现临***症状，对ASFV的细胞免疫应答也较弱。尽管在Benin-ΔA179L攻***后3d的病***血症低于对照非免疫猪，但免疫猪对强***亲本病***Benin 97/1的攻***没有保护作用。因此，猪体内病***复制水平的降低***了保护性免疫反应的诱导。结果表明，A179L蛋白在猪巨噬细胞病***复制和对猪的***力中具有重要作用。
图1：ASFV Benin 97/1***株中A179L基因的缺失
图2：Benin∆A179L感染的细胞中，促凋亡增强
图3：与Benin-mNG相比，基因缺失的BeninΔA179L-mNG在感染后的早期诱导细胞表面Annexin V
图4：用BeninΔA179L免疫和用Benin97/1强***株攻***猪的体温、临***评分、死后宏观病变评分和病***血症
图5：用Benin∆A179L免疫和Benin97/1强***攻***猪的免疫应答
讨论：
宿主细胞通过激活一系列防御机制来***病***复制，并诱导先天和适应性免疫反应。病***感染诱导的信号可通过多种途径激活细胞凋亡。这些信号包括外部信号，如肿瘤坏死因子-a，它与细胞表面受体结合，激活下游的凋亡通路。内在信号可激活促凋亡的BCL-2家族成员，导致线粒体外膜完整性丧失，细胞色素c释放，启动caspase-3和下游caspase介导的裂解。病***已经进化出了一系列抑制细胞凋亡的机制。ASFV编码多种凋亡抑制蛋白，包括IAP家族的成员A224L，应激诱导的凋亡抑制因子DP71L和BCL-2家族成员A179L。
我们的结果证实，敲除BCL-2抗凋亡家庭成员A179L的重组病***Benin∆A179L感染巨噬细胞的早期，caspase-3和caspase-7活性的增强。这一结果是意料之中的，因为A179L在感染后的早期表达，并且与之前的数据A179L作为BCL-2家族的抗凋亡成员的结果相一致。
先前的报道和Annexin V染色显示，在感染含有完整A179L基因的野生型病***后晚期能够诱导细胞凋亡。将凋亡诱导延迟到晚期可以有更多的时间进行病***复制，从而提高感染性子代病***粒子的产量。我们通过另外两项检测证实，与野生型或不感染的细胞相比，A179L基因缺失病***感染的细胞促进了下游凋亡基因的激活。在一项实验中，我们通过结合Annexin V证实，与Benin-mNG相比，感染A179L缺失病***BeninΔA179L-mNG后，细胞表面***脂酰丝氨酸（一个凋亡的早期指标）数量增加。其次，我们观察到，与野生型Benin∆A97/1相比，通过TUNEL DNA片段检测，细胞凋亡诱导显著增加。我们的结论是，缺失A179L基因降低了感染细胞的抗凋亡和促存活活性，导致caspase 3和7活性增加。A179L与BCL-2家族的几个促凋亡成员的结合之前已经被报道过，这种相互作用的去除可能是增加细胞凋亡的机制。在之前的研究中，与Risbon60强***分离株相比，NHP/68分离株感染猪巨噬细胞后的早期，caspase 3的诱导作用增加。在感染这两种病***后，在感染后的后期，观察到相似水平的细胞凋亡。在之前的研究中，我们也观察到，在caspase 3***zVAD-fnk的存在下，晚期也能够诱导细胞凋亡。因此，在感染后期观察到的细胞凋亡，可能除了是由caspase 3激活诱导的途径外，还可能是由其他途径介导的。
我们还发现，从一个强***分离株Benin 97/1的基因组中敲除A179L基因，在多步生长曲线上显著减少了病***在巨噬细胞中的复制。然而，在单周期生长曲线上，感染******的产量与野生型Benin 97/1病***非常相似。令人惊讶的是，活细胞成像检测细胞感染重组病***后表达mNeonGreen荧光报告基因的情况，显示细胞感染A179L基因缺失病***BeninΔA179L-mNG，与Benin 97/1-mNG相比，在感染早期约40%的细胞在6 hpi时表达mNeonGreen，在16 h达到峰值约80%的细胞表达mNeonGreen。此后，细胞数量下降，但感染率保持同样高，直到约30 hpi，然后下降。相比之下，通过mNG的表达来检测，感染Benin-mNG的细胞数量要低得多。在6 hpi时，只有不到10%的细胞被感染，但该百分比稳步增加，在感染后约40小时达到~80%细胞表达的平台期。由于细胞被相同的BeninΔA179L-mNG和Benin-mNG病***的低MOI（0/1）感染，我们可能预期相同数量的细胞会在第一个复制周期中表达mNG荧光蛋白。虽然观察到更多的细胞表达mNG，因此感染了BeninΔA179L-mNG，但在16至20 hpi的时间内获得了类似的感染******数量，如图1e所示。对这一观察结果的一种可能的解释是，从感染BeninΔA179L-mNG的培养物中获得的更高比例的病***粒子可以有效地进入细胞并表达蛋白质，但不能产生完全感染的子代病***粒子，这可能是由于凋亡更早地发生导致的。我们还需要进一步的研究来证实这一假设。我们预测，如果我们将感染标准化为基因组拷贝数，而不是传染******粒子，我们仍然会观察到，与Benin 97/1-mNG相比，感染BeninΔA179L-mNG的细胞中的早期基因表达增加，尽管可能没有达到这种程度。
在BeninΔA179L-mNG缺失突变病***感染后的早期，mNeonGreen阳性细胞的数量较高，这表明该病***的进入率和感染的起始率较高。ASFV从宿主细胞出芽时，获得来自宿主质膜的外包膜。病***粒子可能含有携带感染性ASFV病***粒子的凋亡小体，也有助于病***进入。我们观察到，与感染具有完整A179L基因的Benin-mNG病***相比，从感染早期开始，感染的细胞的Annexin V结合增加，该病***具有完整的A179L基因。目前已知多种包膜病***家族的成员将***脂酰丝氨酸合并到它们的细胞膜中，通过与宿主细胞膜上的***脂酰丝氨酸受体结合，介导的“凋亡模拟”增强细胞进入。ASFV已被证明可以通过受体介导的内吞作用和大胞吞作用进入细胞。后者在巨噬细胞中可以作为替代突进入侵细胞，而不依赖于病***特异性受体。细胞凋亡拟态可能解释了感染缺乏A179L基因的病***的细胞感染率的增加。潜在的凋亡模拟也可以扩展ASFV的细胞嗜性。它还可能保护病***粒子免受抗体的影响，导致无法检测到在其他研究中观察到的完全中和性抗体。由于缺乏外膜的成熟ASFV病***粒子也具有传染性，因此它们的表面不会暴露出表面***脂酰丝氨酸，而是可能通过受体介导的内吞作用进入细胞。然而，凋亡小体也有表面***脂酰丝氨酸，因此细胞内病***粒子在凋亡小体中合并并被未感染的巨噬细胞上的***脂酰丝氨酸受体吸收的传播，可以为这些病***粒子的扩散提供另一条途径。我们还没有评估在我们的制备过程中包含外包膜或凋亡小体中存在的病***粒子的比例，因此需要进一步的证据来研究这些假设。
我们在感染低MOI缺失A179L基因的病***的多步生长过程中观察到病***的传播减少，至少部分是由于细胞数量的减少导致的。由于被感染的细胞比例较高，细胞数量的下降可能是由于被感染细胞早期诱导凋亡和达到成熟的病***粒子数量的减少。也有可能是从受感染细胞释放的病***减少有助于减少传播，如在HIV-1上的报道一样。在病***出芽阶段，HIV-1可以被一个***脂酰丝氨酸结合的TIM家族受体家族捕获在细胞表面，这可以通过HIV***性因子（Nef）通过诱导这些受体的内化来抵消。
对猪的免疫接种结果表明，A179L基因的缺失大大减弱了Benin97/1病***的***力。用BeninΔA179L免疫或加强免疫猪后，未观察到临***表征和病***血症。除了在一头猪中外，没有检测到抗p72 ASFV抗体。通过IFN-γ ELISpot检测到细胞免疫应答，但猪对亲本***猪Benin 97/1的攻击没有保护作用。与未免疫的对照猪相比，BeninΔA179L 3d免疫猪的病***血症明显降低，但在攻***后的几天，免疫猪和对照猪之间的病***血症水平没有差异。我们假设，在体内，病***复制不足，可以诱导有效的保护性免疫反应。
与我们对A179L的研究结果相比，从ASFV基因组中缺失其他凋亡抑制因子并不会减少病***在细胞中的复制或对猪的***力。ASFV IAP家族成员A224L被认为可以直接与加工过的caspase 3片段相互作用，以抑制caspase 3下游的细胞凋亡。尽管有这些抗凋亡活性，但从强***分离株中敲除A224L基因并没有减少猪巨噬细胞培养中的病***复制，也没有减少凋亡的诱导。该基因的缺失也没有降低对感染猪的***力。
ASFV DP71L蛋白抑制转录因子CHOP/ATF4介导的细胞凋亡通路。敲除DP71L基因对猪体内病******力的影响因病***分离株的不同而不同。因此，E70分离株的缺失降低了猪的***力，而马拉***因型VIII分离物的缺失并没有降低***力。
我们的研究结果表明，在感染Benin∆A179L病***的巨噬细胞中，caspase 3活性的增加和诱导凋亡与猪的复制和病***的减少相关。然而，我们不能排除A179L蛋白的其他功能的作用，例如，抑制自噬调节因子Beclin-1。ASFV不编码其他已知的BCL-2家族成员，因此A179L可能是线粒体凋亡途径的唯一抑制因子。这可能解释了与其他凋亡抑制因子相比，敲除A179L基因对病***复制和***力的影响更大。我们的研究结果首次证明了A179L BCL-2家族凋亡抑制因子在巨噬细胞和猪的病***复制过程中发挥的重要作用。结果表明，操纵细胞凋亡可以通过为抗病***药物的设计提供靶点或帮助设计新型***。
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